Cov yam cuam tshuam hauv PCR cov tshuaj tiv thaiv

Thaum lub sijhawm PCR tshuaj tiv thaiv, qee yam cuam tshuam feem ntau ntsib.
Vim yog qhov rhiab heev ntawm PCR, kev ua qias tuaj yeem suav hais tias yog ib qho tseem ceeb tshaj plaws uas cuam tshuam rau cov txiaj ntsig PCR thiab tuaj yeem tsim cov txiaj ntsig tsis tseeb.
Qhov tseem ceeb ib yam li ntawd yog ntau yam uas ua rau muaj cov txiaj ntsig tsis tseeb. Yog tias ib lossis ntau qhov tseem ceeb ntawm PCR sib xyaw lossis qhov kev ua kom muaj zog ntxiv raug txwv lossis cuam tshuam, qhov kev kuaj mob tuaj yeem raug cuam tshuam. Qhov no tuaj yeem ua rau txo qis kev ua haujlwm thiab txawm tias cov txiaj ntsig tsis tseeb.
Ntxiv rau qhov kev txwv tsis pub ua, qhov poob ntawm lub hom phiaj nucleic acid yuav tshwm sim vim yog kev xa khoom thiab / lossis cov xwm txheej khaws cia ua ntej npaj cov qauv. Tshwj xeeb, qhov kub siab lossis kev khaws cia tsis txaus yuav ua rau puas tsuaj rau cov cell thiab nucleic acids. Kev kho cell thiab cov ntaub so ntswg thiab kev ntxig paraffin yog cov ua rau DNA tawg thiab yog qhov teeb meem tas li (saib Cov Duab 1 thiab 2). Hauv cov xwm txheej no, txawm tias kev cais tawm thiab kev ntxuav kom huv si zoo tshaj plaws yuav tsis pab.

Daim Duab 1 | Cov nyhuv ntawm kev tsis txav mus los rau ntawm kev ua kom DNA zoo
Agarose gel electrophoresis qhia tau hais tias qhov zoo ntawm DNA cais tawm ntawm cov seem paraffin ntawm kev kuaj lub cev sib txawv ntau heev. DNA ntawm qhov nruab nrab sib txawv qhov ntev ntawm cov khoom rho tawm nyob ntawm txoj kev kho. DNA tsuas yog khaws cia thaum kho hauv cov qauv khov hauv zos thiab hauv cov formalin tsis muaj zog. Kev siv cov tshuaj kho Bouin uas muaj zog heev lossis tsis muaj buffered, formic acid-muaj formalin ua rau DNA poob ntau heev. Cov seem seem yog fragmented heev.
Ntawm sab laug, qhov ntev ntawm cov khoom seem yog qhia hauv kilobase khub (kbp)

Daim Duab 2 | Kev poob ntawm kev ncaj ncees ntawm cov hom phiaj nucleic acid
(a) Ib qho 3′-5′ qhov sib txawv ntawm ob txoj hlua yuav ua rau muaj kev tawg hauv lub hom phiaj DNA. kev tsim cov DNA tseem yuav tshwm sim ntawm daim me me. Txawm li cas los xij, yog tias qhov chaw primer annealing ploj ntawm daim DNA, tsuas yog linear amplification tshwm sim. Hauv qhov xwm txheej zoo tshaj plaws, cov daim yuav rov ua dua ib leeg, tab sis cov txiaj ntsig yuav me me thiab qis dua qib kev kuaj pom.
(b) Kev poob ntawm cov hauv paus, feem ntau yog vim depurination thiab thymidine dimer tsim, ua rau muaj kev txo qis ntawm cov lej ntawm H-bonds thiab kev txo qis hauv Tm. Thaum lub sijhawm sov so ntev, cov primers yuav yaj ntawm cov matrix DNA thiab yuav tsis anneal txawm tias nyob rau hauv cov xwm txheej tsis nruj heev.
(c) Cov hauv paus thymine uas nyob ib sab tsim ib lub TT dimer.
Lwm qhov teeb meem uas feem ntau tshwm sim hauv kev kuaj mob molecular yog qhov tso tawm tsawg dua qhov zoo tshaj plaws ntawm cov nucleic acids piv rau phenol-chloroform extraction. Hauv cov xwm txheej hnyav, qhov no tuaj yeem cuam tshuam nrog cov cuav tsis zoo. Ntau lub sijhawm tuaj yeem txuag tau los ntawm kev rhaub lysis lossis enzymatic zom cov cell khib nyiab, tab sis txoj kev no feem ntau ua rau PCR rhiab heev tsawg vim tsis txaus nucleic acid tso tawm.

Kev txwv ntawm polymerase kev ua ub no thaum lub sijhawm amplification

Feem ntau, kev txwv tsis pub siv yog siv los piav qhia txog txhua yam uas ua rau muaj cov txiaj ntsig PCR tsis zoo. Hauv kev nkag siab txog biochemical, kev txwv tsis pub siv tsuas yog rau kev ua haujlwm ntawm cov enzyme, piv txwv li, nws txo lossis tiv thaiv kev hloov pauv ntawm cov khoom siv los ntawm kev sib cuam tshuam nrog qhov chaw nquag ntawm DNA polymerase lossis nws cov cofactor (piv txwv li, Mg2 + rau Taq DNA polymerase).
Cov khoom hauv cov qauv lossis ntau yam buffers thiab cov extracts uas muaj cov reagents tuaj yeem ncaj qha inhibit lub enzyme lossis ntes nws cov cofactors (piv txwv li EDTA), yog li ntawd inactivate lub polymerase thiab ua rau cov txiaj ntsig PCR txo qis lossis cuav tsis zoo.
Txawm li cas los xij, ntau qhov kev sib cuam tshuam ntawm cov khoom sib xyaw thiab cov nucleic acids uas muaj lub hom phiaj kuj raug xaiv ua 'PCR inhibitors'. Thaum lub cell raug cuam tshuam los ntawm kev cais tawm thiab cov nucleic acid raug tso tawm, kev sib cuam tshuam ntawm cov qauv thiab nws cov kua nyob ib puag ncig thiab cov khoom khov kho tuaj yeem tshwm sim. Piv txwv li, 'scavengers' tuaj yeem khi ib lossis ob txoj hlua DNA los ntawm kev sib cuam tshuam tsis yog covalent thiab cuam tshuam nrog kev cais tawm thiab kev ntxuav los ntawm kev txo cov naj npawb ntawm cov hom phiaj uas thaum kawg mus txog PCR reaction vessel.
Feem ntau, cov tshuaj PCR inhibitors muaj nyob rau hauv feem ntau cov kua dej hauv lub cev thiab cov tshuaj reagents siv rau kev kuaj mob hauv tsev kho mob (urea hauv cov zis, hemoglobin thiab heparin hauv cov ntshav), cov khoom noj khoom haus ntxiv (cov khoom xyaw organic, glycogen, rog, Ca2+ ions) thiab cov khoom hauv ib puag ncig (phenols, cov hlau hnyav)

Cov tshuaj PCR inhibitors uas muaj ntau dua tuaj yeem pom muaj nyob rau hauv cov kab mob bacteria thiab eukaryotic cell, cov DNA uas tsis yog lub hom phiaj, cov macromolecules uas khi DNA ntawm cov ntaub so ntswg matrices thiab cov khoom siv hauv chaw kuaj mob xws li hnab looj tes thiab yas. Kev ntxuav cov nucleic acids thaum lossis tom qab rho tawm yog txoj hauv kev zoo tshaj plaws rau kev tshem tawm cov tshuaj PCR inhibitors.
Niaj hnub nim no, ntau yam khoom siv rho tawm tsis siv neeg tuaj yeem hloov ntau yam kev cai tes, tab sis 100% rov qab thiab / lossis ntxuav cov hom phiaj yeej tsis tau ua tiav. Tej zaum yuav muaj cov tshuaj inhibitors nyob rau hauv cov nucleic acids uas tau ntxuav lossis tej zaum twb tau ua haujlwm lawm. Muaj ntau txoj hauv kev los txo qhov cuam tshuam ntawm cov tshuaj inhibitors. Kev xaiv cov polymerase tsim nyog tuaj yeem muaj kev cuam tshuam loj rau kev ua haujlwm ntawm inhibitor. Lwm txoj hauv kev uas tau ua pov thawj los txo PCR inhibition yog nce qhov concentration ntawm polymerase lossis siv cov khoom ntxiv xws li BSA.
Kev txwv tsis pub muaj PCR cov tshuaj tiv thaiv tuaj yeem pom tseeb los ntawm kev siv kev tswj xyuas zoo sab hauv (IPC).
Yuav tsum tau ceev faj kom tshem tawm tag nrho cov tshuaj reagents thiab lwm yam tshuaj hauv cov khoom siv rho tawm, xws li ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol thiab phenol, ntawm cov nucleic acid isolate los ntawm kev ntxuav kom huv si. Nyob ntawm lawv qhov concentration, lawv tuaj yeem ua haujlwm lossis inhibit PCR.